Ablak bezárása X

Eötvös 2020+: az Akadémia nagyot lépett a Kormány innovációs céljainak támogatásában

Milliókat menthetne meg a vérből való rákszűrés

Óriási előrelépést hozna a rák diagnosztikájában, kezelésében és szűrésében, ha megbízhatóan ki lehetne mutatni a fejlődő daganatból a vérbe kerülő anyagokat. Számos laboratóriumban dolgoznak olyan vértesztek előállításán, amellyel igen korai, még kezelhető formájában lehetne felfedezni a betegséget. Az mta.hu összeállítása.

2016. június 7. Tátrai Péter

A rákellenes kezelések sikere nagyban függ attól, mennyire korán sikerül felismerni a daganatot. Csakhogy a test belsejének rejtekében növekvő szövetszaporulat gyakran semmiféle nyilvánvaló tünetet nem produkál. Amíg el nem éri azt a méretet, amely mellett már a környező szöveteket, szerveket elnyomva fájdalmat, funkciózavart vagy egyéb panaszokat okoz, felismerésére valamilyen más okból elvégzett vizsgálat „melléktermékeként”, illetve szűrővizsgálat révén kerülhet sor. Mire magának a daganatnak a tünetei orvoshoz viszik a beteget, a rákos sejtek már valószínűleg számos genetikai változatot hoztak létre, ami megnehezíti a megfelelő terápia kiválasztását.

Így aztán akár a daganatos betegség első jelentkezéséről, akár egy korábbi tumor kiújulásáról van szó, létfontosságú a mielőbbi felismerés és a daganat genetikai jellemzőinek felderítése. De hogyan azonosítsunk egy daganatot, amely még semmilyen érzékelhető jelét nem adja a létezésének? És hogyan vegyünk a genetikai elemzéshez mintát egy daganatból, amelyről azt sem tudjuk, létezik, nemhogy a helyét ismernénk?

Ráksejtek DNS-e a vérben

Bert Vogelstein, a Johns Hopkins Egyetem tumorgenetikai és rákgyógyászati központjának (Ludwig Center for Cancer Genetics and Therapeutics) igazgatója világszerte sok más kutatóval együtt úgy gondolja, hogy a fenti kérdésekre adott válasz a vérben rejtőzik.

A daganatokat ugyanis nemcsak fokozott osztódás, hanem a normálisnál magasabb sejtpusztulási ráta is jellemzi, és a széteső tumorsejtekből kiszabaduló DNS bekerül a vérkeringésbe.

Ez a keringő tumor-DNS (cirkuláló tumor-DNS vagy ctDNS) nemcsak a rejtett daganat létéről, de genetikai jellemzőiről is árulkodik.

Vogelstein laboratóriuma csak egy az egyre sokasodó kutatóhelyek közül, amelyek a rák jelentkezésének vagy kiújulásának felismerését, illetve a ráksejtek folytonos változásának nyomon követését lehetővé tévő vérteszt kidolgozásán munkálkodnak. A vér könnyen és viszonylag fájdalommentesen hozzáférhető, tehát a vérminta mint „folyékony biopszia” ideális helyettesítője lehetne a daganatból szúrás vagy műtét útján kinyert hagyományos szövetmintának. Ráadásul a daganat a vérben már jóval azelőtt nyomot hagy, hogy bármely egyéb módszerrel kimutatható lenne.

Ám mint a legtöbb, első pillantásra eszményinek tűnő megoldás, a vérből történő daganatdiagnosztika is számos kihívást rejt magában. Legjobb lenne a rákot akkor felfedezni és a kezelését megkezdeni, amikor még csak kisszámú sejt alkotja; ám egy pár ezer vagy tízezer sejtből álló sejthalmaz szinte kimutathatatlanul csekély mennyiségű DNS-t bocsát ki a vérbe. Minél apróbb a daganat, annál valószínűbb, hogy a „kiáltása” elvész az összes keringő szabad DNS hangzavarában. Tovább nehezíti a keresést, hogy a daganat ismerete nélkül nem tudhatjuk, melyek azok a genetikai elváltozások, amelyek a tumor-DNS-t megkülönböztetik a jóval nagyobb mennyiségben jelen lévő, nem tumoros keringő DNS-től. Tehát nem elég meghallanunk a tumor kiáltását a fülsiketítő háttérzajban: meg is kell ismernünk a hangját.

A keringő szabad DNS diagnosztikus célra történő felhasználásának kezdetei az 1990-es évek végére nyúlnak vissza. Dennis Lo, aki ma a Hongkongi Kínai Egyetem professzora, akkoriban főleg a magzati rendellenességek noninvazív – minimális beavatkozást igénylő – kimutatása iránt érdeklődött. Először kidolgozta annak módját, hogy miként lehet a magzati DNS-t az anya vérében azonosítani, majd alig tíz év alatt kifejlesztette a Down-szindróma anyai vérmintán alapuló szűrővizsgálatát. Ám mindeközben figyelme egyre inkább a daganatok véralapú diagnosztikája felé fordult. A tumoreredetű DNS még a magzati DNS-nél is kisebb mennyiségben kerül a keringésbe, ám a szekvenálási (DNS-olvasási) technológia egyidejű fejlődése egyre érzékenyebb detektálásra adott módot.

Szinte valamennyi daganatnál megtalálták

A daganat csekély mennyiségű DNS-ből való kimutatására akkor kínálkozik a legjobb lehetőség, ha tudjuk, hogy a daganatsejtek milyen genetikai elváltozást hordoznak.

Ebben az esetben minden olyan keringő DNS-töredék, amely a tumorra specifikus mutációt hordoz, a daganat létezéséről árulkodik, s a mutáns DNS mennyisége még annak méretéről is tájékoztat.

2007-ben Vogelstein csapata ezt a megközelítést alkalmazta a vastagbélrák noninvazív nyomon követésére 18 páciens esetében. Az általuk alkalmazott eljárás a DNS azon tulajdonságát használta ki, hogy az egyszálú DNS-molekulák erősen és fajlagosan kötődnek a velük komplementer bázissorrendű DNS-hez. Miután a vérből izolált valamennyi DNS-darabkát polimeráz-láncreakció segítségével megsokszorozták, parányi mágneses gyöngyökhöz rögzített oligonukleotid-„csalikat” használva „kihalászták” a mutációt hordozó töredékeket. A mágneses gyöngyöket azután elválasztották a keveréktől, és meghatározták a kinyert DNS-darabok mennyiségét.

A betegekből először a daganat műtéti eltávolítása előtt, majd azt követően vettek vérmintát. A vérteszt a betegek többségénél a sebészi beavatkozás után is jelezte a tumoreredetű DNS jelenlétét, noha annak mennyisége a műtét előttinek törtrészére csökkent. A műtét után fennmaradó ctDNS arról tanúskodott, hogy a daganatot nem sikerült maradéktalanul eltávolítani, és csakugyan: ezeknél a pácienseknél egytől egyig kiújult a betegség. Azon keveseknél azonban, akiknek a véréből a műtét után elvégzett teszt nem mutatott ki tumoreredetű DNS-t, a daganat nem tért vissza.

Vogelsteinék azóta kimutatták, hogy nemcsak a végbélrákból, hanem szinte valamennyi daganatféleségből kiszabadulnak és kerülnek a vérbe beszédes DNS-darabkák. A csoport 2014-ben bejelentette, hogy az általuk vizsgált, 640 daganatos betegből álló csoportban a vérminták 75 százaléka tartalmazott ctDNS-t. Az előrehaladott hasnyálmirigy-, petefészek-, vastagbél- és emlőrákok jellemzően több ctDNS-t bocsátanak ki, míg az agy-, vese- és prosztatatumorok viszonylag kevesebbet, bár az előrehaladott esetekben a találati arány itt is elérte az 50 százalékot.

Tüdőrák kezelése vérvizsgálat alapján

A tumorból származó DNS többet is elárulhat a daganatról annak puszta létezésénél és méreténél: mivel a tumorra jellemző mutációk is kiolvashatók belőle, ezek alapján megjósolható lehet, hogy a daganat várhatóan válaszolni fog-e egy adott gyógyszeres kezelésre. Az EU központi gyógyszerhatósága, az Európai Gyógyszerügynökség 2015-ben engedélyezett egy szűrővizsgálatot, amely a tüdőrákos betegek véréből határozza meg a daganat válaszkészségét a gefitinib nevű szerre. A gefitinib csak azokra a daganatsejtekre hat, amelyek egy bizonyos mutációt hordoznak, így a vérből kimutatott mutáns DNS indikációt jelent a gyógyszer alkalmazására. Ez azért is jelent fontos előrelépést, mert a tüdőtumorokból nem könnyű szövetmintához jutni: a szúrás nemcsak fájdalmas, de olykor eredménytelen is lehet, ha a kinyert szövetdarab nem tartalmaz elegendő tumorsejtet a diagnosztikus értékeléshez.

Előbb lehet észlelni a gyógyszer-rezisztenciát

Ugyanilyen lényeges, hogy a vérbe kiszabaduló tumor-DNS segítségével követhetővé válik a daganat genetikai jellemzőinek változása a kezelés hatására. Minél jobb – értsd: a tumorsejtek minél nagyobb hányadát elpusztító – gyógyszerekkel rendelkezünk, annál erősebb szelekciós előnyt élveznek azok az alpopulációk, amelyek képesek kitérni a csapás elől. A kezelés nyomán ezért a daganatsejtek újabb és újabb, a gyógyszernek egyre inkább ellenálló genetikai változatokat hoznak létre. Ha a vér ctDNS-frakciójában új, rezisztenciára valló mutációk jelennek meg, az jelzés lehet a fennálló kezelés intenzitásának módosítására, egyúttal a mutációk elemzése segíthet a következő kezelés kiválasztásában.

A londoni Rákkutató Intézet munkatársai Delila Tandefelt vezetésével bebizonyították, hogy a ctDNS vizsgálata alapján hónapokkal hamarabb észrevehető a gyógyszer-rezisztencia kialakulása, mint a hagyományos klinikai követés – pl. CT-felvételek – útján. Az általuk vizsgált prosztatarákos betegeket az abirateron nevű gyógyszerrel kezelték, de amint a vérükben megjelent a rezisztenciára valló mutáns ctDNS, rögtön átálltak egy másik szerre.

Emberéletek millióit menthetné meg

Bár ezek a kezdeti eredmények a maguk nemében kétségkívül lenyűgözőek, a területen dolgozók érzik, hogy egyelőre csak a könnyen leszakítható gyümölcsöt szüretelik.

A valódi kihívást ugyanis nem a már daganattal diagnosztizált és kezelés alatt álló betegek megfigyelése, hanem a klinikailag tünetmentes népesség szűrése jelenti.

Mivel még a jómódú országokban is a rákos megbetegedések csaknem fele (az angol Cancer Research UK 2014-es adatai szerint az esetek 46 százaléka) kései, előrehaladott stádiumban kerül felismerésre, egy korai diagnózist lehetővé tévő vérvizsgálat emberéletek millióit menthetné meg.

Ha tudjuk, hogy a szervezetben daganat lakozik, és a molekuláris jellemzőit is ismerjük, viszonylag könnyen tervezhetünk tesztet a kimutatására. De mit tegyünk, ha mindez az ismeret nem áll a rendelkezésünkre? Ha nem azonosítottunk egyetlen keresett specifikus mutációt sem, valamennyi lehetséges mutációra nyitva kell tartanunk a szemünket. Ráadásul egy korai stádiumú daganat elenyészően kevés ctDNS-t bocsát ki, s így kell az ismeretlen mutáció után kutatnunk. „A vérrel az a gond, hogy tele van mindenféle dologgal, miközben a daganatból származó anyag alig akad benne” – összegzi szemléletesen a problémát Daniel Haber, a bostoni székhelyű Massachusettsi Általános Kórház rákközpontjának igazgatója.

Ismeretlen mutációk után kutatni egy, a kimutathatóság határán billegő mintában esélytelenebb feladat, mint tűt keresni a szénakazalban – ám szerencsére a kérdést más módon is meg lehet közelíteni. A daganatok a mutációkon kívül egyéb gyanús dolgokat is művelnek a DNS-ükkel, például előszeretettel veszítik el vagy sokszorozzák meg kromoszómáik egy-egy szakaszát.

Ha a vérben keringő összes DNS-t feltérképezzük, és kiderül, hogy egyes DNS-szakaszok a vártnál magasabb vagy alacsonyabb arányban fordulnak benne elő, az a mutációkhoz hasonlóan egy daganat árulkodó jele lehet.

Vogelsteinék 2012-ben összesen 10, kései stádiumú mell- vagy vastagbélrákos betegtől vett vérmintán végezték el a fenti elemzést. Mind a 10 betegben megtalálták a tumorokra jellemző DNS-szerkezeti eltéréseket, míg a 10 egészséges kontrollalany egyikének vérmintája se mutatott efféle elváltozást. Az azonban sajnos nem garantált, hogy a módszer a korai rák kimutatására is alkalmas, amikor a tumor-DNS még alulreprezentált a vérben; hovatovább a szerkezeti eltérések puszta megállapítása semmit sem mond arról, hogy csakugyan baljós vagy csupán ártalmatlan változatokról van-e szó.

De hol van a daganat?

S ezzel még nem értünk a végére a nehézségeknek. Ha a vizsgálat valóban elég érzékeny lesz ahhoz, hogy a legapróbb daganatot is kimutassa, olykor óhatatlanul hamis pozitív eredményt szolgáltat majd. Ahhoz, hogy a tévedés esélyét kizárjuk, a diagnózist más módszerrel, például képalkotó eljárással is meg kell erősíteni – ez viszont visszavezet a kimutathatósági mérethatár problémájához. És még ha olyan szerencsések vagyunk is, hogy a számtalan lehetséges mutáció közül éppen a megfelelőre vadászunk, és rábukkanunk a vérben a ráksejtek molekuláris lenyomatára, honnan tudjuk majd, hol keressük a daganatot a szervezetben? Néha a mutáció milyensége informatív: a KRAS gén elváltozása például leginkább a tüdő, a hasnyálmirigy és a vastagbél rákjaira jellemző. Máskor viszont a mutáció semmit sem árul el a daganat hollétéről: idesorolhatók például a p53 gén mutációi, amelyek szinte bármilyen daganatban előfordulhatnak.

A vérlemezkék segíthetnek

A jó hír az, hogy a ctDNS-en kívül a daganatok más nyomokat is hagynak a vérben. Nemcsak a széteső tumorsejtek DNS-e kerül a vérbe, hanem olykor teljes, élő ráksejtek is a keringésbe sodródnak.

Nemcsak a széteső tumorsejtek DNS-e kerül a vérbe, hanem olykor teljes, élő ráksejtek is a keringésbe sodródnak.

Bár a rákos betegek vérében csupán minden milliárd vérsejtből egy származik a daganatból, és ezek is inkább csak az előrehaladott betegségben jelennek meg, a mutáns DNS-hez hasonlóan e ritka sejtek – ezúttal fehérjetermészetű ellenanyaggal – kihalászhatók és összegyűjthetők. Márpedig a komplett tumorsejtek lényegesen többet elárulnak a daganatról, mint egy-egy DNS-darab. Hasonlóan értékes információt szolgáltathatnak a vérlemezkék, amelyek a daganat közelében elhaladva RNS-darabkákat gyűjtenek be a tumorsejtektől.

Ezeknek az RNS-töredékeknek a leolvasásával sokat megtudhatunk a daganatsejtek lehetséges helyéről és működésük belső titkairól. Thomas Wurdinger és munkatársai az amszterdami Vrije Egyetem orvostudományi központjában a vérlemezkék által begyűjtött RNS elemzése alapján 96 százalékos biztonsággal el tudták különíteni a daganatos páciensek vérmintáit az egészséges kontrollokéitól; sőt, az esetek 71 százalékában a daganat helyét is eltalálták. Ott vannak aztán az exoszómák, a daganatsejtekről lefűződő apró sejthártyatasakok, amelyek mintegy mintát vesznek a sejt DNS-, RNS- és fehérjeállományából.

Tavaly a Texasi Egyetem houstoni rákközpontjában sikeresen különböztették meg hasnyálmirigyrákos és egészséges emberek vérmintáit pusztán a keringő exoszómák fehérjetartalma alapján.

Bár a ctDNS-tesztek érzékenysége és pontossága még sok kívánnivalót hagy maga után, a többi keringő tumorszármazék diagnosztikus célú azonosítása pedig még gyerekcipőben jár, már most jól látható, hogy a vérnek mint folyékony biopsziának idővel egyre nagyobb lesz a szerepe a daganatos betegségek kezdeti felismerésében és kezelésük követésében. Vogelstein rámutatott: a daganat kialakulása felé vezető első genetikai elváltozások és a betegség klinikai horizonton való megjelenése között 20-30 év is eltelhet. „Az Egyesült Államokban várhatóan nagyjából 55 ezer ember hal meg az idén vastagbélrákban, és valamennyien azért halnak meg, mert a daganatuk nem került felismerésre a kialakulásától számított első 27 év alatt” – nyomatékosította mondandóját, érzékeltetve, hogy a véralapú szűrővizsgálatok már a mai, tökéletlen állapotukban is mennyire értékes eszközei lehetnek a daganatok elleni küzdelemnek.

(Az összeállításhoz felhasználtuk a New Scientist 2016. március 16-ai számában megjelent, How a simple blood test could spot cancer earlier című cikket.)


Lépések a tumorok korai diagnosztizálására

Nagy Bálint habilitált egyetemi docens, a Debreceni Egyetem Általános Orvoskar Humángenetikai Tanszékének vezetőjeNagy Bálint, az MTA doktora kommentárja

A megbetegedési és halálozási statisztikák élén a tumoros megbetegedések állnak. Az új esetek száma 2012-ben elérte a 14 milliót, a halálozások száma a 8,2 milliót. Az új betegek száma a következő két évtizedben várhatóan 70%-kal fog növekedni (WHO Cancer Reports 2014). Ezek az adatok mutatják, hogy a korai diagnosztikában és a kezelések monitorizálása során is lépéseket kell tenni a rohamosan növekvő számú betegpopuláció korszerű, hatékony ellátása érdekében.

Erre jó példa a „folyadék biopszia” mintavételi eljáráson alapuló diagnosztikai és prognosztizáló módszerek kifejlesztése. A „szabad” DNS jelenlétét már 1947-ben leírta Mandel és Métais, de felfedezésük sokáig nem keltett különösebb érdeklődést. Leon és munkatársai 1977-ben elkezdték alkalmazni a „szabad” DNS-t a tumordiagnosztikában és a kezelés monitorizálásban, de az utóbbi néhány évig nem történt áttörés a területen. Ellenben Dennis Lo a magzati diagnosztikában már 1997-ben sikeresen alkalmazta az anyai vérben 5-10%-ban jelen lévő „szabad” DNS-t a magzat nemének és RhD vércsoportjának meghatározására a nem invazív módon nyert mintákból.

Nagy volt az érdeklődés a magzati triszómiák kimutatása iránt, erre azonban csak az új generációs szekvenálási módszerek (NGS) bevezetése adta meg a lehetőséget 2011-ben. Az NGS már a klinikai gyakorlatba is bevezetésre került – elnevezése Non-Invasive Prenatal Testing (NIPT). Annak ellenére, hogy több százezer mintáról állnak rendelkezésre klinikai adatok, és a módszer specificitása és szenzitivitása eléri a 99,9%-ot a 21. kromoszóma triszómiájának a kimutatására, az NIPT még nem „NIPD”, azaz diagnosztika. A pozitív eredményeket a hagyományos invazív módon (amniocentézis, méhlepény-biopszia) nyert minták kariotipizálásával meg kell erősíteni, mert még mindig ez az „arany standard” módszer.

A tumorok diagnosztikája ennél sokkal bonyolultabb, és nagyon kevés adat áll rendelkezésre a „folyadék biopsziával” nyert minták feldolgozása során nyert eredményekről és klinikai tapasztalatokról. A tumordiagnosztika területén még nagyon messze vagyunk az NIPT-vel elért 99,9%-os specificitástól és szenzitivitástól.

Napjainkban a tumorok hagyományos invazív eljárással nyert szövettani és molekuláris diagnosztikai vizsgálata a standard elfogadott diagnosztikai eljárás.

Ez lehetőséget nyújt olyan genotipizálások elvégzésére is, amelyek segítik a célzott terápia kiválasztását. Az elmúlt években a „folyadék biopszia” nagy reményeket nyújt a cirkuláló tumor-DNS (ctDNS) molekulák felhasználásával a korai tumordiagnosztika és a terápia felállításához. Ezek a nukleinsavak az apoptotizáló és a keringő tumorsejtekből származnak.

A ctDNS a tumorsejtekből jut a vérbe, és az eredeti tumor mutációit tartalmazza. Az új generációs szekvenálók kifejlesztésével napjainkban lehetőség nyílik a genetikai eltérések specifikus és érzékeny kimutatására a nem invazív módon vett mintákból. Ez jelentősen segítheti a jelenlegi tumordiagnosztikát, lehetőséget nyújthat a tumor korai kimutatására, a prognózis és a kezelés meghatározására, a személyre szabott gyógyítás bevezetésére.

A tumorok genotipizálása nagyon fontossá vált a kezelések során, főként az immunoterápia alkalmazásakor. A klinikai gyakorlatban a genotipizálás szöveti biopsziákból történik, ez a minta azonban nem alkalmas a tumor heterogenitásának és állandó változásainak valós idejű monitorizálására, erre jobban megfelel a vérből izolált ctDNS. Számos tanulmány bizonyította, hogy a ctDNS gyorsan képes előjelezni a terápia kimenetelét, és fontos információt nyújt a klinikusnak a további kezelések megtervezéséhez.

Súlyos probléma a terápiarezisztencia kialakulása, ez a kezelések sikertelenségének legfőbb oka.

A legújabb eredmények felhívják a figyelmet arra, hogy a folyadék biopsziával nyert minták felhasználásával a tumorrezisztencia a jelenleginél jóval korábban jelezhető.

A folyadék biopsziával nyert mintákból izolált ctDNS lehetőséget nyújthat a jövőben a tumorok korai diagnosztizálásához és a genotipizálások eredményeinek felhasználásával a kezelések hatékonyabbá tételéhez, a kezelés hatékonyságának a monitorizálásához, a személyre szabott terápia bevezetéséhez.

A módszer elterjedéséhez és elfogadtatásához szükséges a ctDNS keletkezésének, a sejtekből történő kibocsátás és véráramba kerülés biológiájának a jobb és pontosabb megismerése. Napjainkban még kevés adat áll rendelkezésre a klinikai és analitikai validitásról, továbbá a klinikai hasznosságról. Nem szabad elfeledkezni arról sem, hogy a vérből izolálható „szabad” nukleinsavak magukba foglalják a microRNS-, mRNS- és nem kódoló long RNS- (nclRNS-) molekulákat is, amelyek további segítséget nyújthatnak abban, hogy megismerjük a tumoros megbetegedések kialakulásának molekuláris mechanizmusát, megkönnyíthetik a korai diagnosztizálást, és a kezelésekben is új utat nyithatnak.