Magyar kutatók fejlesztése teszi sokkal hatékonyabbá a genetikai szerkesztést

A CRISPR-Cas9 rendszeren alapuló génszerkesztés az elmúlt évtizedben forradalmasította a génmódosítást, hiszen olyan precizitású változtatásokat lehet a segítségével végrehajtani az örökítőanyagban, amelyek azelőtt elképzelhetetlenek voltak. Bár a CRISPR-alapú génszerkesztés nagy pontosságú, nem tévedhetetlen, így a precizitásán volt még mit fejleszteni. Ennek érdekében fejlesztették ki néhány évvel később a bázisszerkesztés (base editing) és a prime szerkesztés (prime editing) eljárásokat, amelyek nagy előnye az volt a klasszikus génszerkesztéshez képest, hogy már nem kellett hozzájuk elvágni a DNS mindkét láncát, így kisebb lett az esélye, hogy a láncok rosszul kapcsolódnak ismét össze.

Csakhogy ezek a módszerek sem tökéletesek: nem mindig pontosan ott olyan változások történnek a hatásukra a DNS-ben, mint ahogy azt a genetikusok elvárnák. E problémára kínál forradalmi megoldást a HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont és a HUN-REN Természettudományi Kutatóközpont munkatársai által kifejlesztett új génmódosító módszer, amelyet „meghosszabbított szerkesztési ablakú prime szerkesztésnek” (prolonged editing window prime editing, proPE) neveztek el, és amelyet a Nature Catalysis folyóiratban publikáltak a minap. Az új eljárás sok tekintetben gyökeresen hatékonyabb és pontosabb, mint bármely más alkalmazható módszer, így nagy valószínűséggel jelentősen hozzájárul majd a génszerkesztés klinikai alkalmazásaihoz is.

„A tanulmányunk egy új génszerkesztő eljárás kifejlesztéséről és optimalizálásáról szól – magyarázza Krausz Sára, a tanulmány első szerzője. – Az eljárás a prime szerkesztés, egy új generációs génszerkesztő technológia továbbfejlesztése, amelynek segítségével sok esetben hatékonyabban és specifikusabban tudjuk szerkeszteni a DNS-t.

Ezáltal olyan betegséget okozó mutációk is javíthatókká válnak, amelyek korábban a prime szerkesztéssel nem voltak elérhetők.”

A prime szerkesztés (PE) egészen új génszerkesztő módszer, hiszen mindössze hat évvel ezelőtt mutatták be a felfedezői. Az alapja egy két enzimből álló komplex, amelyben a génszerkesztésből ismert és a DNS mindkét szálát hasítani képes Cas9 endonukleáz enzim helyett egy másik változatot, a Cas9 nikázt használják. A nikáz csak a DNS egyik szálát hasítja el. A komplex része még egy másik enzim is, a reverz transzkriptáz. Ez a fajta enzim a retrovírusokból lehet ismerős, és funkciója, hogy RNS-minta alapján képes DNS-t szintetizálni. A PE-komplex harmadik összetevője az úgynevezett pegRNS (vagyis a prime szerkesztést vezető RNS). Ez a különleges, kizárólag a prime szerkesztésben alkalmazott nukleinsav egyszerre szolgál célzó rendszerképpen (tehát az enzimkomplexet pontosan a szerkesztendő DNS-szekvenciához vezeti), és tartalmazza a beépítendő új génszekvencia mintájául szolgáló RNS-szakaszt is. Benne a beépítendő szekvencia akár húsz vagy még több bázis hosszú is lehet – a pontosság mellett a hosszúság a prime szerkesztés egyik legnagyobb előnye például a csupán egy bázist kicserélő bázisszerkesztéshez képest.

Hogyan működik a prime szerkesztés? Először a két enzimből és a pegRNS-ből álló PE-komplex rátalál a specifikusan módosítandó génszakaszra a pegRNS részét képező célzószekvencia segítségével (ennek komplementer szekvenciája a célpont). Ezután a Cas9 nikáz elhasítja (tudományos szlenggel: nikkeli) a DNS egyik szálát. A reverz transzkriptáz a mintaszekvencia alapján új DNS-szakaszt szintetizál, amely ezután a hasítás helyén beépül a módosítandó DNS-be, míg a korábbi szerkesztetlen DNS-szálszakasz kivágódik belőle. A következő lépésben az elhasított szál szabad végei újra összekapcsolódnak, de ekkor a szerkesztett és a szerkesztetlen szál nukleotidjai ideiglenesen nem lesznek komplementerek. Emiatt működésbe lépnek a DNS hibajavító mechanizmusai, és a szerkesztetlen szál nukleotidjait olyan bázisokra cserélik, amelyek már megfelelnek az új (szerkesztett) szekvenciának.

„Mi úgy fejlesztettük tovább a prime szerkesztést, hogy ezzel

az eredeti módszer legalább öt különböző hiányosságán tudtunk jelentősen javítani.

Így összességében nőtt az eljárás hatékonysága – mondja Welker Ervin, az MTA doktora, a kutatás vezetője. – Egy második vezető RNS-szekvenciát is beépítettünk a módosítókomplexbe, ami jelentősen csökkenti a módosítás során fellépő molekuláris gátlóhatásokat. A módszerünk sokkal specifikusabb minden egyéb hozzáférhető eljárásnál, tehát jobban meg tudjuk határozni a génváltoztatás helyét, és a változtatás jellegét is pontosabban irányíthatjuk.”

A kutató elmondta, hogy az új eljárás segítségével a célzáshoz használt génszekvenciától távolabb eső mutációkat is sokkal nagyobb hatékonysággal tudják kijavítani a DNS-en. Összességében sokkal biztonságosabbá válik ezáltal a prime szerkesztés, ami a legfontosabb alapfeltétele annak, hogy egyszer majd a genetikai betegségeket okozó mutációkat rutinszerűen ki tudják javítani az orvosok a betegek genomjában. Addig, amíg az eljárások nem képesek garantálni, hogy a beavatkozás során csak ott módosulnak a beteg génjei, ahol a patogén mutáció található, és csak olyan módosítások történnek a génben, amelyek javítják e hibát, addig a génszerkesztés esetenként nagyobb bajt okozhat, mint amekkora problémát meg akar oldani. Ennek kiküszöbölésében jelentenek nagy előrelépést a magyar kutatók eredményei.