A genomszerkesztés svájci bicskája: a CRISPR/Cas9 rendszer

Az élővilágban az örökítőanyag univerzális formája a DNS (dezoxiribonukleinsav), amelynek építőkövei a nukleotidok. A nukleotidok négyfélék lehetnek, ezek egymás utáni sorrendje kódolja a genetikai információt. A humán genom (az örökítő anyag összessége egy sejtben) közel 3,1 milliárd nukleotidja 23 kromoszómába rendeződik, minden egyes kromoszóma egyetlen összefüggő DNS molekula. A kromoszómák működési egységei a gének, amelyek végső termékei (nemkódoló RNS-ek és fehérjék) építik fel és működtetik sejtjeinket, valamint határozzák meg öröklődő tulajdonságainkat.

Az örökítőanyag megváltozása a gének és géntermékek szerkezeti és funkcionális megváltozásához vezethet. Már egyetlen nukleotid cseréje is egy aminosav megváltozását eredményezheti a kódolt fehérje szerkezetében, amely végül egy patológiás folyamat (betegség) kialakulásához vezethet. Például a p53 tumorszuppresszor fehérjében – amely feladata, hogy gátolja a sejtosztódását és elősegítse a kóros sejtek elpusztulását – akár egyetlen kulcsfontosságú aminosav megváltozása tumorfejlődést indukálhat. Terápiás megoldást jelenthetne, ha a mutáns p53 gén szerkezetében vissza tudnánk állítani az eredeti nukleotidsorrendet, s ezáltal helyre tudnánk állítani a kódolt fehérje normális aminosavsorrendjét.

De hogyan lehet egyetlen nukleotidot kicserélni egy genomban?

Nukleotidszintű, irányított DNS-változtatásokra az elmúlt évtizedekben nem vagy csak alig volt lehetőség, mivel a vizsgált génekben csak nagyrészt véletlenszerű változásokat tudtak a genetikusok indukálni. Egy mutálódott gén eredeti szerkezetének gyógyászati célú visszaállítására idáig csak nagyon korlátozott lehetőségek álltak a rendelkezésünkre. Ám a Charpentier és Doudna által kifejlesztett CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9 – rövid, fordított ismétlődésekkel elhatárolt szekvenciák genomi régiója/CRISPR-kapcsolt nukleáz 9) genomszerkesztő rendszer arra ad lehetőséget, hogy nukleotid-szinten lehessen a DNS-ben tárolt genetikai információt tetszőleges helyen, nagy hatékonysággal és pontosan módosítani. Ezért lett a CRISPR/Cas9 rendszer a genomszerkesztés precíziós svájci bicskája. A következő évtizedek tudományos fejlődéseit éppen ez a technológia, és az idetartozó alap- és orvosbiológiai kutatások és alkalmazások fogják döntően meghatározni. Úgy is fogalmazhatunk, hogy a CRISPR/Cas9 genomszerkesztő rendszer révén mind a genetika, mind a medicina lehetőségei kozmikus méretűre tágulhatnak. A módszerben rejlő lehetőségek méltán vetekszenek a molekuláris biológia robbanásszerű fejlődését lehetővé tevő PCR (polymerase chain reaction – polimeráz-láncreakció) technológia jelentőségével.

A CRISPR/Cas9 rendszer a baktériumok genomi immunválaszaként fejlődött ki az evolúció során. Leginkább a baktériumokat fertőző és bennük elszaporodó vírusok – az úgynevezett fágok - elleni védekezés fő molekuláris fegyverzete. Amikor egy fág egy baktériumsejtet megfertőz, akkor a vírus bejutó genetikai anyaga átprogramozza a gazdasejt működését, és azt a vírus anyagainak szintézisére készteti. A folyamat eredményeként a gazdasejtben új vírusrészecskék szintetizálódnak, aminek következtében a baktériumsejt jobbára elpusztul. Ám az a baktériumsejt, amelyik túlél egy ilyen fágfertőzést, képessé válik arra, hogy a fertőző vírus genomjának egy részletét a saját genomjába integrálja, és ezáltal „emlékezni tud” a fertőző ágens genetikai identitására. Azt a genomi régiót a DNS-ben, ahová a baktériumsejt az idegen virális genomdarabot elraktározta, CRISPR szakasznak nevezzük. A CRISPR rész tehát a baktérium evolúciós múltjában átélt fágfertőzések genomi lenyomatait őrzi egy-egy vírus genomrészlet formájában (genomszintű immunológiai memória). A baktérium így képes különbséget tenni a „saját” és „idegen” (fertőzésként a gazdasejtbe jutott) DNS szakaszok között. A CRISPR régió tehát rövid, ismétlődésekkel határolt, fágeredetű DNS szakaszok együttese. Egy következő fertőzés során a baktériumsejt először a CRISPR régióról transzkripció (génátírás) révén ún. pre-crispr RNS (pre-crRNS) átiratot készít. A pre-crRNS aztán feldarabolódik, és az így keletkező rövid crispr RNS-ek (crRNS) nagymértékű szekvencia-specificitást mutatnak a támadó fág egy genomi részletével. A baktériumgenom egy másik része a CRISPR-rel szomszédos, ún. Cas régió, amely olyan Cas nukleázokat kódol, amelyek képesek a duplaszálú DNS molekula mindkét szálának szekvencia-specifikus elhasítására. A crRNS segítségével ismeri fel a Cas fehérje az elhasítandó vírus genomot. A crRNS és Cas között a kapcsolatot egy harmadik szereplő, az ún. tracer RNS (tracRNS) teremti meg.

A genomszerkesztéshez használt Cas9 fehérje több mint 1350 aminosavat tartalmaz és hat különböző fehérjedoménből épül fel, amelyek téralkata, önszerveződése és hatékony együttműködése gyors és pontos. A HNH és a RuvC nevű két nukleázdomén óraműpontossággal hasítja ketté a felismert idegen DNS-t.

Ez a molekuláris gépezet olajozottan működik, a molekuláris svájci bicska pontosan hasít.

Érdemes megemlíteni azt, hogy az eukarióta (sejtmagvas) élőlényekben is működik egy olyan genetikai apparátus, amely a baktériális CRISPR/Cas rendszerhez hasonló funkcióval bír. Az eukarióta genomokat (pl. emlős sejteket) szintén fertőzhetik virális patogének, amelyek a sejtmagba jutva beékelődnek egy adott genomi pozícióba. Onnan aztán képesek akár több ezer kópiában is lemásolódni és további genomi pozíciókba beékelődni. Az évmilliók során így alakultak ki a mobilis genetikai elemek (MGE-ek) vagy más néven az „ugráló gének”. Ilyen MGE-eredetű ismétlődő szekvenciák alkotják a humán genom közel felét. Ezek a mozgó DNS-darabok „ugrálásuk” során szinte bármilyen kromoszómarészbe befészkelődhetnek, és ezáltal inszerciós mutációkat hozhatnak létre, amelyek nagyfokú genomi instabilitást okoznak a befogadó DNS-helyeken. Könnyen belátható, hogy az ugráló gének blokkolása kulcsfontosságú az élőlények hosszú távú fennmaradása érdekében. Minden egyes MGE családból egy kópia az ún. piRNS (Piwi-kölcsönható RNS) genomi régióba kerül, ahonnan átíródva egy adott piRNS a Piwi-fehérjéket arra ösztökéli, hogy elhasítsák az adott MGE géncsalád RNS-átiratait (mRNS), ezáltal gátolva azok mozgását. A nem öregedő, korlátlan osztódási potenciállal rendelkező csíravonal- és rákos sejtekben a Piwi-piRNS rendszer hatékonyan gátolja a MGE-ek aktivitását, biztosítva eme sejtek genetikai stabilitását. A bakteriális CRISPR és az eukarióta piRNS genomi régiók tehát egymás funkcionális analógjai. Mindkét rendszer kijelöli az „idegen” eredetű, vírusfertőzéssel bejutott genetikai elemeket, és közvetíti azok gátlását.

Emmanuelle Charpentier (balra) és Jennifer A. Doudna a nobelprize.org grafikáján Forrás:nobelprize.org

Charpentier és Doudna a Cas nukleázok ezen tulajdonságait (szekvenciaspecifikus DNS-hasítás) és a bennük rejlő biotechnológiai potenciált (nukleotidpontosságú genomszerkesztés) ismerték fel elsőként. Később a tracRNS-t és a crRNS-t fuzionáltatták, és egy ún. guide (irányító) RNS-t (gRNS) hoztak létre. Egy mindössze 20 nukleotid hosszúságú gRNS már elegendő ahhoz, hogy akár a 3,1 milliárd nukleotid hosszúságú humán genomban egy specifikus felismerést, majd DNS-vágást tegyen lehetővé. A kettősszálú DNS-vágás azonban sejthalált okozna, ezért azt azonnal javítja a sejt DNS-hibajavító gépezete. Éppen ebben rejlik a felfedezés igazi csodája. A kutató egy adott helyen belehasít a DNS-be, amely azonban ismét összeforr, de közben el lehet a „genomszerkesztést” végezni. Ugyanis a CRISPR/Cas9-cel elhasított szabad DNS-végek összeillesztésére két javítógépezet is rendelkezésre áll a sejten belül, amelyek egymással versengve javítják a DNS-vágást. Egyrészt az NHEJ (non-homologous end joining – nem homológ végek összeragasztása), másrészt a homológ rekombináció (HR) molekuláris apparátusa képes az elvágott DNS szálak „összeragasztására”. Az elhidrolizált észterkötés visszaalakítására van tehát két molekuláris rendszer – mondhatná a szerves kémikus. Az NHEJ egy gyors és hatékony, de nem pontos mechanizmus a szabad DNS-végek összeillesztésére. A javítás során így gyakran képződnek hibák, néhány nukleotid ugyanis vagy kimarad, vagy éppen „feleslegbe” kerül a DNS-javítás helyén.

A DNS molekula irányított, tetszőlegesen kiválasztott nukleotidja mentén történő hasítás óriási lehetőségeket rejt magába. Elvileg bármely organizmus, bármely génjében egy kiválasztott nukleotid mellett megtörténhet a kettősszálú DNS hasítás. A lézerkéspontosságú vágáshoz csupán egyetlen specifikusan megszerkesztett gRNS-re és egy Cas9 nukleázra van szükség. Ha a javítás az NHEJ mechanizmussal történik, akkor viszonylag könnyen lehet mutáns génformákat előállítani. A genetikai analízis számára a CRISPR/Cas9-közvetített irányított mutagenezis óriási lehetőségeket kínál. Ha viszont a javítást a HR-apparátus végzi el, akkor a hasítás helyére tetszőleges DNS szekvenciát lehet beépíteni egy megfelelően kiválasztott homológ (donor) DNS szakasz alkalmazásával. Ebben az esetben persze a Cas9-gRNS mellett a homológ DNS-szakaszt is be kell juttatni a sejtbe. Ilyen módon lehet pl. riportergéneket beékelni egy kópiában endogén szekvenciákba a leolvasási keret fenntartásával. Ezzel bármely gén expressziós mintázata meghatározhatóvá válik, ha a megfelelő pozícióba beszerkesztünk egy riportergént (pl. gfp – zöld fluoreszcens fehérje). De HR-rel le lehet cserélni a „rossz” (mutáns, betegséget okozó) nukleotidokat a laboratóriumban előzetesen megszintetizált „jó” szekvenciákra.

A patológiát okozó DNS-szekvenciák kicserélése „normális” szekvenciákra kiemelt orvosbiológiai jelentőséggel bír, hiszen így lehet egészséges sejtvonalakat és szerveket genetikailag megszerkeszteni, és ezzel a test működését potenciálisan helyreállítani. Laboratóriumi körülmények között állatmodellekben már eredményes kísérletek valósultak meg pl. a cisztás fibrózis, az izomdisztrófia, az amiloidképződés vagy a szürkehályog genomszerkesztéssel történő terápiájára vonatkozóan.

Bár a CRISPR/Cas9 rendszer már ma is lélegzetelállítóan hatékony, de azért még messze nem tökéletes. Számos esetben a rendszer aspecifikus helyen, tehát nem a gRNS által kijelölt pontos cél DNS-szekvenciánál is hasít. Ezért a ma zajló fejlesztések főként ennek kiküszöbölésére irányulnak. Az örökletes genetikai betegségek megszüntetése vélhetőleg olyan pozitív fogadtatásra számíthat, mint amikor a 20. században felfedezett antibiotikumok és vakcinák következtében megszűnt számos tömeges megbetegedés. Miután azonban a nukleotidpontosságú DNS-szerkesztés elvileg már teljesen biztonságos (specifikus) lesz, azután is számos kétely és etikai megfontolás fogja a módszer alkalmazását övezni.

Mert mi lenne a jövőnkkel, ha DNS-ünket szabadon átszabhatnánk?

Hibás gének kijavításával meggyógyíthatjuk ugyan öröklődő betegségeinket, de mit jelenthet ez az ökoszisztémát, a Föld egészét tekintve? Azok a genetikai változtatások, amelyeket például a nem öregedő, tehát korlátlan osztódási potenciállal rendelkező csíravonal sejteken végeznének el, mindörökké velünk maradnának leszármazottainkban, s ezzel korábban sohasem látott módon és mértékben befolyásolnánk a jövőnk alakulását. Bár a módszer lehetőségei korlátlannak tűnnek, de hol van az emberi beavatkozás természetes határa? Valóban szebb lesz ettől a jövőnk? Milyen lesz majd genomszerkesztett világunk az A. Huxley közismert "Szép új világ" című regényében olvasottakhoz képest?

Vellai Tibor az ELTE TTK Genetikai Tanszék , Perczel András pedig az ELTE TTK Szerves Kémiai Tanszék munkatársa.